Tacky quick

Luogo e data di emissione: Brescia – 3 Febbraio 2003

Titolo

Valutazione dell’attività rigenerante di un prodotto fitoterapico attraverso sperimentazioni in vitro su colture cellulari di cheratinociti.fibroblasti e tessuto osseo(Test MTT).

Scopo

Il saggio MTT può essere eseguito al fine di valutazione l’eventuale attività rigenerante di un prodotto su colture cellulari.Il test in vitro risulta essere un metodo sperimentale in grado di dare molte informazioni sulle reazioni che possono verificarsi in vivo.

 

Sponsor

 

OAXIS

Via Rizzotto,3/A

00043 Ciampino (RM)

 

Monitor

Dott.ssa Elena BOCCHIETTO

Biologa specialista in Applicazioni Biotecnologiche/Consulente per: BIO BASIC EUROPE  S.r.l

Tel. (02) 4155729

Fax.(02) 4150184

 

Controllo qualità

 

Dr. Claudio ANGELINETTA Direttore Tecnico

BIO BASIC EUROPE S.r.l

Tel. (02) 4155729

Fax.(02) 4150184

 

Sperimentatore

 

Dott.ssa Nadia Losio

Centro Ricerca applicata ai Substrati Cellulari

Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia.

Via A. Bianchi 7/9

25124 Brescia

Tel.(030)  22901

Fax(030)225613

 

 

Valutazione dell’attivà rigenerante di un prodotto fitoterapico attraverso sperimentazioni in vitro su colture cellulari di

cheratinociti,fibroblasti e tessuto osseo

 

 

Il cheratinocita è il principale tipo cellulare che compone l’epidermide e partecipa attivamente a tutti gli aspetti funzionali che caratterizzano. I cheratinociti utilizzati negli esperimenti in vitro qui condotti sono di tipo primario,cioè provengono da una biopsia di cute sana di un donatore.

I fibroblasti sono presenti nel derma, lo strato cutaneo sottostante l’epiderme,il loro compito è quello di

sintetizzare il collagene e le altre fibre che compongono la matrice extracellulare del derma. I fibroblasti che sono stati utilizzati sono di tipo primario,derivati da derma umano.

 

Per questi esperimenti sono state inoltre utilizzate cellule di tessuto osseo provenienti da osteosarcoma umano.La vitalità delle cellule esposte in  vito a diverse concentrazioni di prodotto

 

viene valutata rispetto a cellule non trattate,mediante la metodica MTT.

Il saggio MTT è semplice ,accurato e da risultati riproducibili.Questo metodo è stato svilup- pato in origine da Mossman(1993).

Il componente più importante è il 3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5 –diphenyl tetrazolium bromuro o MTT.Questo prodotto ha un colore giallognolo in soluzione.La deidrogenasi mitocondriale di cellule vitali rompe l’anello tetrazolico,portando alla formazione di cristalli color porpora insolubili in solu- zioni acquose.I cristalli sono ridisciolti in isopropanolo acidificato e la soluzione purpurea risultante è misurata spettrofotometricamente.Un aumento o una diminuzione nel numero delle cellule,in concomitanza con le variazione nella quantità di formanzo formato,indicano il grado di citossicità o l’eventuale attività rigenerante della sostanza testata.

 

 

 

 

Preparazione dei campioni


Materiali e Metodi

 

Le cellule in coltura sono trattate con concentrazioni scalari del prodotto testato comprese tra

0,002 e 10 mg/ml. Colture cellulari

Si sono utilizzate colture di:

Cheratinociti provenienti da biopsie di pelle umana. Fibroblasti,provenienti da derma umano,

Cellule di tessuto osseo provenienti da osteosarcoma umano

Le cellule sono state seminate in maniera omogenea in piastre da 96 pozzetti per l’esecuzione degli esperimenti.

Terreno di coltura

 

I cheratinociti sono stati incubati in CEC + in presenza di siero fetale bovino (FCS)al 3%. I fi- broblasti sono stati incubati in MEM (Minimal Essential Medium)- Sodio –Piruvato + 5% di siero fe- tale bovino(FCS). Le cellule di tessuto osseo sono state  incubate in Mc COY’S + 5% di siero

fetale bovino(FCS).

 

 

Esecuzione del test

 

 

Un numero adeguato di cellule (10.000 cell/pz per cheratinociti e fibroblasti  e 15.000 cell/pz per le cellule di tessuto osseo) viene seminato nei pozzetti(piastra da 96 pozzetti,150 μ)

 

 

 

 

 

Rielaborazione dei dati sperimentali forniti dal Centro Ricerca applicata ai Substrati Cellulari – Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna-Brescia.

 

Stimolazione della crescita cellulare

 

 

 

 

 

 

 

Cheratinociti


Fibroblasti

Dopo 48 ore di incubazione con il campione

 

 

 

 

Nelle condizioni di crescita analiz- zate concentrazioni di prodotto comprese tra 0,078 e 10 mg/ml dopo 24- 72 ore di incubazione

non  hanno dimostrato di posse- dere un’attività stimolante la cre-

scità cellulare.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

L’attività stimolante la crescita cellulare risulta essere presente solo per le concentrazioni di pro- dotto comprese tra 0,002 – 0,167 mg/ml.

 

Tessutoosseo

Dopo 24 ore di incubazione con il campione

 

 

 

 

 

 

 

 

Riepilogo dei dati  rilevati e valutazione dell’attività rigenerante del prodotto sottoposto alla  sperimentazione

 

 

 

 

 

Il campione testato

 

 

 

 

 

 

Dimostra di avere attivita’ rigenerante su colture cellularidi tessuto osseo di provenienza umana

 

 

 

Dopo 24 ore di incubazione il campione risulta avere una  maggiore attivita’

rigenerante a concentrazioni comprese tra 0,019 e 1,5 mg/ml.

 

 

 

Nelle condizioni di crescita analizzate il prodotto ha dimostrato di possedere un’attivita’ stimolante la crescita cellulare significativa su fibroblasti